FISH試劑

0.075M KCl                                                    （2月一次）

固定液（甲醇：冰醋酸＝3 ： 1）                    （一周一次）

2×SSC                                                          （PH=7.0,一周一次）

2×SSC 0.1%NP40                                         （PH=7.0,一周一次）

0.4*SSC 0.3%NP40                                       （PH=7.0,一周一次）

70％、85％、100％乙醇                                （一周一次）

樣本玻片制備步驟

一、采集樣本

1.1 外周血不少于2ml×2（WBC計(jì)數(shù)大于20×10⁹），EDTA抗凝，4℃保存小于3天

1.2 骨髓不少于1ml×2（BM增生明顯活躍），肝素抗凝，保存時(shí)間小于3天，4℃保存

二、標(biāo)本前期處理

2.1 .樣本2500R離心8 min，讓血細(xì)胞沉淀，去上清，留沉淀

2.2 沉淀+ 0.075M KCl混合（1ml樣本 ＋ 8ml KCl），吸管吹勻，水浴箱37℃低滲 30 min

2.3 取出按樣本：固定液＝10：1比例加固定液，固定液不的超過(guò)1 ml

2.4 混勻，吹散細(xì)胞，1800R 離心 8 min

2.5 去上清，留沉淀，加5～10ml 固定液（不得超過(guò)10ml），混勻，靜置10 min（吸去底部絮狀沉淀）

2.6 重復(fù)2.4～2.5步驟2次，（外周血2洗3次，骨髓3～4次）

2.7 去上清液，加少許固定液1～2min 4℃保存1～2月（保存樣本）

三、標(biāo)本玻片制備

3.1 保存樣本離心，加新鮮固定液，配制適當(dāng)濃度滴到載玻片上，觀察標(biāo)本質(zhì)量（10 Cell/HP）

3.2 室溫（20℃～37℃）2×SSC（Ph 7.0）液中浸泡2 min（老化）

3.3 依次室溫（20℃～37℃）70%、85％、100％乙醇中浸泡2 min（脫水）待干，

3.4 適當(dāng)區(qū)域滴加探針液6 ul ，18×18 蓋玻片封蓋，封片膠密閉封片無(wú)氣泡、無(wú)空隙；待干

四、變性雜交

4.1 雜交儀**程序75℃變性1～2min，37℃雜交不小于16 h（過(guò)程中保持濕度，濕條＋潤(rùn)濕紗布?jí)K）

五、洗片

5.1 小心去掉蓋玻片和封片膠

5.2 在75℃水浴箱中，玻片浸泡在0.4×SSC、0.3％NP40(pH7.0)（72℃+/-1℃）液中2 min

5.3 晾干，在2×SSC、0.1％NP40（pH7.0）室溫中浸泡30s（背景信號(hào)好壞）

5.4 晾干，加6ul DAPI antifade 到載玻片上，18×18蓋玻片

5.5 暗環(huán)境，熒光顯微鏡觀察

制片完成后，在顯微鏡下觀察不同顏色的熒光探針，并在專業(yè)的FISH圖像處理軟件（http://www.enurse.cn/naturegene_Product_17737660.html）中采集圖像和進(jìn)行后期的圖像分析處理。